Willkommen in der faszinierenden Welt der Mikrobiologie! Wenn Sie neu im Labor sind oder einfach nur verstehen möchten, wie mikrobiologische Proben ausgewertet werden, sind Sie hier genau richtig. Die Bestimmung von Werten auf Agarplatten, insbesondere auf TSA-Platten (Tryptic Soy Agar) und SAB-Platten (Sabouraud Dextrose Agar), ist eine Kernkompetenz in vielen Laboren – von der Lebensmittel- und Pharmaindustrie bis hin zu Umweltlaboren.
Dieser umfassende Leitfaden führt Sie Schritt für Schritt durch den Prozess und vermittelt Ihnen das nötige Wissen, um diese wichtigen Aufgaben sicher und korrekt auszuführen. Wir erklären Ihnen, was diese Platten sind, wie Sie die darauf wachsenden Mikroorganismen erkennen und zählen und welche Fehler Sie vermeiden sollten. Machen Sie sich bereit, die unsichtbare Welt sichtbar zu machen!
Grundlagen der Mikrobiologie für Einsteiger: Warum zählen wir überhaupt?
Mikroorganismen sind winzige Lebewesen wie Bakterien, Hefen und Schimmelpilze, die überall in unserer Umgebung vorkommen. Viele von ihnen sind harmlos, einige nützlich, aber andere können Krankheiten verursachen oder Produkte verderben. In vielen Bereichen ist es daher entscheidend, ihre Anwesenheit und ihre Menge zu überwachen. Genau hier kommt die Agarplatte ins Spiel.
Agarplatten dienen als Nährboden, auf dem Mikroorganismen unter kontrollierten Bedingungen wachsen können. Jedes einzelne, lebensfähige Mikroorganismus-Partikel (Zelle, Spore oder Zellaggregat) kann auf einer geeigneten Platte zu einer sichtbaren Kolonie heranwachsen. Diese Kolonien sind der Schlüssel zu unserer Messung. Wir sprechen hierbei von Koloniebildenden Einheiten, kurz KBE (engl. Colony Forming Units, CFU).
Das Ziel ist es, die Anzahl dieser KBEs pro Volumeneinheit (z.B. ml) oder Gewichtseinheit (z.B. g) der ursprünglichen Probe zu bestimmen. Dies gibt uns Aufschluss über die mikrobiologische Qualität oder Kontamination einer Probe.
TSA-Platten: Der Allrounder für Bakterien
Was ist TSA und wofür wird es verwendet?
TSA steht für Tryptic Soy Agar (manchmal auch Trypticase Soy Agar genannt) und ist eines der am häufigsten verwendeten, universellen Nährmedien in der Mikrobiologie. Es ist reich an Nährstoffen und fördert das Wachstum einer breiten Palette von aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien. Aufgrund seiner Vielseitigkeit wird es häufig für folgende Anwendungen eingesetzt:
- Allgemeine Keimzahlbestimmung (Gesamtkeimzahl).
- Umweltmonitoring (Oberflächen, Luft, Wasser).
- Sterilitätstests von pharmazeutischen Produkten.
- Kultivierung und Erhaltung von Bakterienkulturen.
Wie sehen Bakterienkolonien auf TSA aus?
Bakterienkolonien auf TSA-Platten können sehr vielfältig sein. Es ist wichtig, auf verschiedene morphologische Merkmale zu achten, um verschiedene Arten voneinander zu unterscheiden:
- Größe: Von punktförmig klein bis mehrere Millimeter im Durchmesser.
- Form: Kreisrund ist am häufigsten, aber auch unregelmäßig, rhizoid (wurzelartig) oder spindelförmig.
- Rand (Margo): Glatt, gewellt, gelappt, gefiedert oder gezackt.
- Erhebung (Elevation): Flach, erhaben, konvex, umboniert (buckelförmig) oder kraterförmig.
- Farbe: Die meisten Bakterienkolonien sind creme-weiß oder gelblich, aber auch Pigmente wie rot, pink, violett oder grün sind möglich.
- Oberfläche (Textur): Glatt, rau, faltig, glänzend, matt, schleimig oder trocken.
- Transparenz: Durchsichtig, durchscheinend oder opak (undurchsichtig).
Die genaue Beobachtung dieser Merkmale hilft Ihnen nicht nur beim Zählen, sondern auch dabei, potenzielle Kontaminationen zu erkennen oder auf verschiedene Bakterienarten in einer Probe zu schließen.
SAB-Platten: Der Spezialist für Pilze
Was ist SAB und wofür wird es verwendet?
SAB steht für Sabouraud Dextrose Agar und ist ein selektives Nährmedium, das speziell für das Wachstum von Pilzen (Hefen und Schimmelpilzen) optimiert ist. Seine Zusammensetzung, insbesondere der niedrige pH-Wert (oft ca. 5,6) und der hohe Glukosegehalt, schafft eine Umgebung, die das Wachstum der meisten Bakterien hemmt und gleichzeitig Pilze optimal fördert. SAB-Platten werden typischerweise eingesetzt für:
- Nachweis und Zählung von Hefen und Schimmelpilzen in Lebensmitteln.
- Umweltmonitoring auf Pilzkontaminationen.
- Diagnostik bei mykotischen Infektionen.
- Kultivierung und Erhaltung von Pilzkulturen.
Wie sehen Pilzkolonien auf SAB aus?
Pilzkolonien unterscheiden sich oft deutlich von Bakterienkolonien:
- Hefen: Hefekolonien ähneln oft Bakterienkolonien, sind aber meist größer, feuchter und cremiger. Sie sind oft rund, glatt, glänzend und von weißlicher bis cremefarbener Erscheinung. Ein charakteristischer, oft süßlicher „Hefegeruch” kann ebenfalls vorhanden sein.
- Schimmelpilze: Schimmelpilze zeigen eine ganz andere Wachstumsform. Sie bilden ein Myzel, ein Geflecht aus fadenförmigen Hyphen, das die Oberfläche des Agars bedeckt und oft in den Agar hineinwächst. Ihre Kolonien sind typischerweise:
- Fuzzy oder wattig: Wie kleine Wattebäusche.
- Samtig oder pulverig: Dichter, oft mit sichtbarer Sporenbildung.
- Farbig: Die Farbe kann variieren von weiß, grau, grün, blau-grün, schwarz bis hin zu rosa oder orange, abhängig von der Art und der Sporenfarbe.
- Wachsen meist langsamer als Bakterien und benötigen längere Inkubationszeiten.
Die Unterscheidung zwischen Hefe- und Schimmelpilzkolonien ist entscheidend für eine korrekte Auswertung.
Der Prozess der Plattenauswertung: Schritt für Schritt zum Ergebnis
Die korrekte Auswertung einer Agarplatte erfordert Sorgfalt, Geduld und eine systematische Herangehensweise.
1. Vorbereitung ist alles
- Inkubation: Stellen Sie sicher, dass die Platten unter den richtigen Bedingungen inkubiert wurden. Typische Temperaturen sind 30-35°C für Bakterien (TSA, 24-48 Stunden) und 20-25°C für Pilze (SAB, 3-7 Tage, manchmal länger).
- Arbeitsplatz: Arbeiten Sie an einem sauberen, desinfizierten Arbeitsplatz mit guter Beleuchtung. Eine Hintergrundbeleuchtung (z.B. durch einen Koloniezähler mit Lichtplatte) kann sehr hilfreich sein.
- Sicherheit: Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Laborkittel und Handschuhe.
2. Visuelle Inspektion
Bevor Sie mit dem Zählen beginnen, inspizieren Sie jede Platte kritisch:
- Kontamination: Suchen Sie nach unerwünschtem Wachstum. Dies können Kolonien sein, die sich stark von den erwarteten unterscheiden, oder Wachstum, das außerhalb des beimpften Bereichs liegt (z.B. am Plattenrand). Eine Kontamination macht die Platte unbrauchbar.
- Ausgebreitetes Wachstum (Swarming): Bei manchen Bakterien (z.B. Proteus-Arten) kann es zu einem schleierartigen, über die gesamte Platte ausgebreiteten Wachstum kommen. Dies erschwert oder verhindert das Zählen einzelner Kolonien.
- Überwucherung (Too Many To Count – TMTC / Überzählig): Wenn eine Platte so dicht mit Kolonien bewachsen ist, dass eine individuelle Zählung unmöglich oder extrem ungenau wäre, wird sie als „überzählig“ oder „Too Many To Count“ (TMTC) bezeichnet. Dies deutet darauf hin, dass die ursprüngliche Probe zu hoch konzentriert war und stärkere Verdünnungen erforderlich sind.
3. Zählmethoden der Kolonien (KBE/CFU)
Das Zählen ist der Kernschritt.
- Manuelles Zählen: Dies ist die gängigste Methode. Verwenden Sie einen Koloniezähler mit Lupe und integrierter Beleuchtung. Die Platte wird auf die beleuchtete Fläche gelegt. Mit einem speziellen Markierstift (oder einem Filzstift auf der Außenseite der Petrischale) markieren Sie jede gezählte Kolonie, um Doppelzählungen oder Auslassungen zu vermeiden. Ein Handzähler (Klickzähler) ist unerlässlich, um den Überblick zu behalten.
- Gittermethode: Bei vielen Kolonien kann es hilfreich sein, die Unterseite der Petrischale in Sektoren oder Quadrate einzuteilen (einige Koloniezähler haben bereits Gitter). Zählen Sie dann Sektor für Sektor.
- Automatisches Zählen: Für Labore mit hohem Probendurchsatz gibt es automatische Koloniezählgeräte. Diese verwenden Kameras und Software, um Kolonien zu erkennen und zu zählen. Sie sind schnell und reproduzierbar, aber teuer und können Schwierigkeiten bei komplexen Koloniemorphologien oder bei sehr dichtem Wachstum haben.
4. Die Magische Zahl: Der ideale Zählbereich
Für eine statistisch verlässliche Auswertung gilt oft ein idealer Zählbereich. Dieser liegt meistens zwischen 30 und 300 KBE pro Platte. Warum dieser Bereich?
- Weniger als 30 KBE: Die statistische Aussagekraft ist geringer. Jede einzelne Kolonie hat einen größeren Einfluss auf das Gesamtergebnis, und zufällige Schwankungen sind wahrscheinlicher. Solche Platten werden zwar gezählt, das Ergebnis aber mit Vorsicht interpretiert oder als „<30 KBE“ angegeben, wenn die Verdünnungsreihe noch höhere Werte auf anderen Platten liefert.
- Mehr als 300 KBE: Die Platte ist überladen. Einzelne Kolonien lassen sich nicht mehr zuverlässig unterscheiden, was zu Fehlzählungen und Ungenauigkeiten führt (TMTC).
Wenn Sie eine Verdünnungsreihe anlegen, sollte immer mindestens eine Platte im idealen Zählbereich liegen.
5. Berechnung der KBE/ml oder KBE/g
Nachdem Sie die Kolonien gezählt haben, müssen Sie das Ergebnis auf die ursprüngliche Probe umrechnen. Die Formel lautet:
KBE pro ml (oder g) = (Anzahl gezählter Kolonien × Verdünnungsfaktor) / Inokulationsvolumen (in ml)
Beispiel:
Sie haben eine Probe um den Faktor 1:100 verdünnt (Verdünnungsfaktor = 100) und 0,1 ml dieser Verdünnung auf eine Platte aufgetragen. Sie zählen 85 Kolonien.
KBE/ml = (85 Kolonien × 100) / 0,1 ml = 85000 KBE/ml
Wenn Sie mehrere Platten einer Verdünnung gezählt haben (z.B. Duplikate), bilden Sie den Mittelwert der gezählten Kolonien.
6. Umgang mit Mischkulturen
Oft finden Sie auf einer Platte Kolonien mit unterschiedlicher Morphologie. Dies deutet auf eine Mischkultur hin (verschiedene Mikroorganismen). In diesem Fall können Sie:
- Alle Kolonien zusammenzählen, um die Gesamtkeimzahl zu erhalten.
- Die Kolonien nach ihrer Morphologie trennen und die Anzahl der KBE für jede morphologische Gruppe separat bestimmen.
- Wenn eine spezifische Identifizierung erforderlich ist, können Sie einzelne Kolonien jeder morphologischen Gruppe entnehmen (Animpfen) und auf eine neue Platte übertragen (Subkultur), um eine Reinkultur zu erhalten und weitere Tests durchzuführen.
Häufige Fehlerquellen und wie man sie vermeidet
Gerade für Einsteiger lauern einige Fallstricke:
- Kontamination: Unsauberes Arbeiten ist die häufigste Fehlerquelle. Achten Sie auf aseptische Arbeitstechniken: saubere Arbeitsflächen, sterile Geräte, korrektes Öffnen und Schließen von Petrischalen.
- Fehler beim Zählen: Übermüdung, Ablenkung, schlechte Beleuchtung oder das Übersehen kleiner Kolonien kann zu Ungenauigkeiten führen. Nehmen Sie sich Zeit, zählen Sie systematisch und machen Sie Pausen.
- Falsche Inkubation: Eine Abweichung von der empfohlenen Temperatur oder Inkubationszeit kann das Wachstum hemmen oder fördern und somit die Ergebnisse verfälschen.
- Pipettierfehler: Ungenaues Pipettieren bei der Verdünnungsreihe führt direkt zu falschen KBE-Werten. Kalibrieren Sie Ihre Pipetten regelmäßig.
- Verwechslung von Bakterien und Pilzen: Besonders Hefen können auf TSA-Platten wachsen und leicht mit Bakterien verwechselt werden. Achten Sie auf Geruch, Größe und typische Merkmale. Bei Unsicherheit sind spezielle Färbungen (z.B. Gram-Färbung für Bakterien) oder mikroskopische Untersuchungen hilfreich.
- Nicht beachtete Verflüssigung des Agars: Manche Bakterien (z.B. Pseudomonas) können Proteine im Agar abbauen und ihn verflüssigen. Dies erschwert das Zählen.
Dokumentation und Interpretation der Ergebnisse
Die genaue Dokumentation ist ebenso wichtig wie das Zählen selbst. Notieren Sie:
- Datum und Uhrzeit der Auswertung.
- Probenbezeichnung und -ID.
- Medium und Chargennummer der Platte.
- Inkubationsbedingungen (Temperatur, Zeit).
- Anzahl der gezählten Kolonien pro Platte und der resultierende KBE/ml-Wert.
- Besonderheiten: z.B. verschiedene Kolonietypen, Anzeichen von Kontamination, TMTC.
- Name des Auswerters.
Die Interpretation der KBE-Werte erfolgt immer im Kontext von Grenzwerten. Diese Grenzwerte sind oft durch gesetzliche Vorschriften (z.B. für Trinkwasser, Lebensmittel, Arzneimittel) oder interne Qualitätsstandards festgelegt. Ein Anstieg der KBE-Werte über diese Grenzwerte hinaus erfordert weitere Maßnahmen.
Fazit
Das Zählen von Kolonien auf TSA- und SAB-Platten ist eine grundlegende, aber äußerst wichtige Fähigkeit in der Mikrobiologie. Es erfordert Präzision, Geduld und ein gutes Auge für Details. Mit diesem Leitfaden haben Sie eine solide Grundlage, um Ihre ersten Schritte in der Plattenauswertung erfolgreich zu meistern.
Denken Sie daran: Übung macht den Meister! Je mehr Platten Sie auswerten, desto sicherer werden Sie in der Erkennung verschiedener Kolonietypen und in der genauen Zählung. Ihre Arbeit trägt maßgeblich zur Qualitätssicherung und Sicherheit bei. Viel Erfolg in Ihrem Labor!